НАБОР ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИКРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)
Основные характеристики набора
- Торговое наименование
- НАБОР ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИКРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА)
- Состав набора
-
- специфический эритроцитарный аденовирусный антиген
- контрольный эритроцитарный антиген
- специфическая гипериммунная сыворотка
- контрольная сыворотка
- сыворотка для разбавителя
- Назначение
- Выявление антител к аденовирусной инфекции крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации
Описание
Действующим началом диагностикума является антиген аденовируса сенсибилизированный в 3% суспензии эритроцитов.
Форма выпуска
Диагностический набор выпускается в жидком виде.
Состав
В состав диагностического набора входят следующие компоненты:
- специфический эритроцитарный аденовирусный антиген – 1 флакон в объеме 13,0 см³
- контрольный эритроцитарный антиген – 1 флакон в объеме 13,0 см³
- специфическая гипериммунная сыворотка - 1 флакон в объеме 1,0 см³
- контрольная сыворотка – 1 флакон в объеме 1,0 см³
- сыворотка для разбавителя – 1 флакон 2,0 см³
Показания для применения
Набор предназначен для выявления антител к аденовирусной инфекции крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации.
Способ применения
В качестве анализируемых образцов используют образцы сыворотки крови от больных и переболевших животных в начале заболевания и через 3-4 недели.
Для проведения исследований направляют не менее 15-20 проб сывороток. Сыворотки хранят в условиях, предотвращающих бактериальный пророст при температуре от 2 до 8°С не более 15 дней.
Для более длительного хранения (до 2 месяцев) возможно добавление борной кислоты в качестве консерванта (2-3 кристаллика на 1,0 см³ сыворотки). Диагностическая гипериммунная сыворотка после растворения может храниться при температуре 2 – 8°С в пробирке под резиновой пробкой до 10 дней.Допускается хранение сывороток при минус 20°С в течение месяца, перед исследованием их размораживают при комнатной температуре.
Парные сыворотки должны исследоваться одномоментно (независимо от результатов первого исследования), для этого первая сыворотка до исследования должна храниться в замороженном виде.
Образцы сывороток с выраженным гемолизом, бактериальным проростом, а также длительно хранившихся без замораживания или повторно замораживаемых не допускается.
Все исследуемые образцы должны быть идентифицированы (промаркированы).
Маркировка компонентов
На флаконы с компонентами наклеивают этикетки с указанием: наименование организация-производителя, ее адрес и товарный знак, наименование компонента, объем во флаконе, номер серии, дата изготовления, рабочее разведения компонента, срок годности, обозначения СТО.
Флаконы согласно комплектации, упаковывают в картонные коробки по ГОСТ 33781 или пластиковые (полистироловые) контейнеры с разделительными перегородками, обеспечивающими их неподвижность и целостность.
В каждую коробку вкладывают инструкцию по применению диагностического набора.
На каждую упаковку с набором флаконов наклеивают этикетку, на которой должны быть указаны: наименование организации-производителя, ее адрес и товарный знак, телефон, наименование компонентов, количество флаконов в коробке, номер серии, дата изготовления (месяц, год), срок годности (месяц, год), количество определений, условия хранения, обозначение СТО.
Подготовка компонентов и растворов для РНГА
Для проведения РНГА необходимо провести следующие подготовительные работы:
- приготовить 0,15 М раствор с рН 7,2-7,4;
- приготовить разбавитель;
- получить исследуемую сыворотку.
Для приготовления 0,15 М раствор с рН 7,2-7,4 в мерную колбу 1,0 л вносят 20,4 г химически чистого безводного однозамещенного фосфорнокислого калия, в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят водой до метки 1,0 литр (раствор А). В другую мерную колбу на 1,0 литр вносят 26,7 г химически чистого двузамещенногофосфорнокислого натрия-двуводного, растворяют в небольшом количестве воды и доводят до метки 1,0 литр (раствор Б). Растворы А и Б можно хранить при температуре 2 - 8°С в течение месяца. Для приготовления буфера к 24,0 см³ раствора А добавляют 76,0 см³ раствора Б и вносят 0,85 г химически чистого хлористого натрия. С помощью pH-метра проверяют pH буфера и при необходимости доводят до pH 7,2-7,4 растворами А или Б.
Для приготовления разбавителя к 100 см³ буфера добавляют 1,0 см³ нормальной сыворотки крови кролика. Для этого флакон с сывороткой встряхивают и содержимое флакона переносят в буфер. Затем разбавитель прогревают при температуре 65-66°С в течение 40 минут, дают остыть при комнатной температуре, добавляют 0,3 см³ формалина и фильтруют через бумажный фильтр. Хранят разбавитель при комнатной температуре в течение месяца. При появлении мути на дне сосуда с разбавителем его снова фильтруют. Мутный разбавитель не используют.
Для проведения диагностических исследованийсывороткуразводят 1:2 дистиллированной водой переносят в стерильную пробирку и прогревают 30 минут при температуре 55 – 57°С.
Флакон с эритроцитарнымантигеномтщательно встряхивают до полной гомогенизации содержимого, стерильно отбирают 1,0 см³ и переносят во флакон с 2,0 см³ разбавителя (0,15М фосфатно-буферный физиологический раствор pH 7,2-7,4, с добавлением нормальной сыворотки кролика в количестве 1,0% от объема буфера).
Выполнение анализа (РНГА)
Реакцию непрямой гемагглютинации ставят микрометодом с использованием полистироловых микропланшет с U-образными лунками для иммунологических реакций однократного применения.
В лунку микропанели вносят по 0,05 см³ разбавителя. В первые лунки каждого ряда вносят исследуемые сыворотки в количестве 0,05 см³. На каждую исследуемую сыворотку необходимо два ряда лунок. Последующими переносами получают двукратные разведения сывороток от 1:2 до 1:4096. Затем в первый ряд лунок вносят по 0,025 см³ 1,0%-ной взвеси специфического эритроцитарного антигенааденовируса, а во второй ряд по 0,025 см³ 1,0%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена. Панель встряхивают, закрывают специальной крышкой и на 2-3 часа оставляют при комнатной температуре.
Реакцию сопровождают следующими контролями:
а) контроль на отсутствие спонтанной агглютинации специфического и контрольного эритроцитарного антигенов.
В два ряда лунок вносят по 0,05 см³ разбавителя, затем в первый ряд лунок вносят по 0,025 см³ 1,0%-ной взвеси специфического эритроцитарного антигена аденовируса, а во второй ряд по 0,025 см³ 1,0%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена;
б) контроль на отсутствие агглютинации специфического эритроцитарного антигена аденовирусаи контрольного эритроцитарного антигена с контрольной сывороткойкрупного рогатого скота.
В два ряда лунок микропанели вносят по 0,05 см³ разбавителя, в первые лунки вносят по 0,05 см³ контрольной сыворотки крупного рогатого скота и титруют. Затем в первый ряд вносят по 0,025 см³ 1,0%-ной взвеси специфического эритроцитарного антигена аденовируса, а во второй ряд по 0,025 см³ 1,0%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена;
в) контроль на активность специфического эритроцитарного антигена аденовирусасо специфической сывороткой крупного рогатого скота. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 см³ разбавителя, в первую лунку вносят 0,05 см³ специфической сыворотки и титруют, как исследуемые сыворотки, затем вносят по 0,025 см³ 1,0%-ной взвеси специфического эритроцитарного антигена аденовирусной инфекции;
г) контроль специфической сыворотки на наличие антител к контрольному эритроцитарному антигену. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 см³ специфической к антигену аденовируса сыворотки и титруют, затем вносят по 0,025 мл 1,0%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена.
Регистрация и учет результатов
Учет результатов реакции проводят через 2-3 часа при комнатной температуре, определяя наличие или отсутствие агглютинации эритроцитов.
Реакцию считают положительной (оценивают на «+», если аглютинировавшиеэритроциты равномерно выстилают дно лунки, образуя форму перевернутого «зонтика».
Реакцию считают отрицательной (оценивают «-» при оседании эритроцитов на дно лунки в виде диска или компактного кольца с четким ровным краем.
Примечание. В первых лунках планшета может наблюдаться «феномен» сползания агглютинированных эритроцитов с образованием по краю лунки кольца с неровным краем (эффект «свертывания зонтика»).
За титр антител в РНГА принимают наивысшее разведение сыворотки, дающую четкую агглютинацию – равномерная агглютинация эритроцитов «зонтик» по всей лунке.
Учёт реакции проводят только при условии четких результатов, полученных в контролях.
Контроли реакции:
- в контрольных лунках на спонтанную агглютинацию эритроциты должны осесть в виде точки или плотного кольца
- титр контрольной сыворотки со специфическим к аденовирусуэритроцитарным антигеном и с контрольным антигеном не должен превышать 1:8
- титр антител специфической сыворотки со специфическим эритроцитарным антигеном аденовирусадолжен быть не ниже 1:128, а с контрольным эритроцитарным антигеном не выше 1:8
Результаты РНГА с испытуемыми сыворотками оценивают по титру антител.Положительным результатом, считают сыворотки, дающие со специфическим эритроцитарным антигеном аденовирусной инфекции титр 1:16 и выше.
При наличии в испытуемых сыворотках антител с контрольным эритроцитарным антигеном в титрах более 1:8, положительными считают сыворотки, которые со специфическим эритроцитарным антигеном аденовирусадали титры в 4 и более раз выше контроля (например: в контроле1:32, то в исследуемой сыворотке должен быть не ниже 1:512).
Диагностика острой аденовирусной инфекции и дифференциация вакцинных антител. Увеличение титров в парных сыворотках в 4 раза и выше, свидетельствует о наличии инфекции.
Порядок предъявления рекламации
В случае несоответствия диагностического набора требованиям, указанным в настоящей инструкции, а также его неэффективности, применение данной серии препарата прекращают. Контроль набора диагностического, поступающей по рекламациям проводит организация-производитель.
Меры предосторожности при применении
При проведении исследований необходимо:
- работать в боксированных помещениях для проведения микробиологических исследований с применением индивидуальных средств защиты (защитной одежды и одноразовых резиновых перчаток);
- следует избегать контакта компонентов с кожей и слизистыми, а при попадании на них незамедлительно промыть большим количеством воды;
- не пипетировать ртом;
- в случае пролива образцов и рабочих растворов на рабочие поверхности, необходимо проводить дезинфекционную обработку с использованием дезинфицирующих средств, эффективность которых подтверждена в отношении используемого в работе возбудителя;
- инструменты и оборудование (до и после работы) подвергать обработке с использованием 70% этилового спирта или дезинфицирующих средств, эффективность которых подтверждена в отношении используемого в работе возбудителя;
- остатки испытуемых сывороток, полистироловые планшеты после учета результатов обеззараживают путем погружения в 3% раствор хлорамина на 5 часов или автоклавирования при 0,5 атм. в течение 30 минут.
- остатки диагностикума и акреолизированных эритроциты барана не требуют особых условий утилизации и могут быть вылиты в канализацию.
Производитель
ООО «Агровет», 109472, г. Москва, ул. Ташкентская, д. 34, корп. 5.